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 La bile et les bactéries


I - Bile et membranes

 

  La bile exerce principalement son effet sur les membranes bactériennes.

 La concentration en bile est très importante dans l'intestin. Une forte concentration en sels biliaires peut rapidement dissoudre les lipides membranaires et déclencher une dissociation des protéines intrinsèques de membrane. Cette dissolution quasi instantanée cause la fuite des contenus cellulaires et la mort bactérienne. De faibles concentrations en acides biliaires peuvent rompre l'intégrité membranaire via des effets plus subtils, sur la perméabilité et la fluidité, y compris en altérant l'activité d'enzymes-clé liés à la membrane, et en accroissant le flux des cations divalents (calcium, magnésium). De faibles concentrations en acides biliaires peuvent également affecter les propriétés physicochimiques des surfaces membranaires, comme l'hydrophobicité ou le potentiel zêta (le potentiel zêta représente la charge électrique qu'une particule acquiert grâce aux ions qui l’entourent quand elle est en solution – bon indicateur des stabilités des émulsions et suspensions).

 Le type et la structure de la bile représentent également des facteurs importants. La liaison des acides biliaires aux lipides membranaires corrèle bien à leur hydrophobicité. Les acides biliaires conjugués sont des acides forts, ils sont habituellement ionisés aux conditions intestinales de pH et demeurent sur la couche externe des membranes (si la cellule n'a pas de système de transport disponible). Les acides biliaires déconjugués peuvent facilement faire un mouvement de flip-flop (retournement) passif et entrer dans bicouche lipidique membranaire et entrer dans la bactérie. Les taux de flip-flop dépendent du nombre des groupes hydroxyles (OH) ; les acides biliaires dihydroxylés entrent rapidement, les trihydroxylés sont plus lents.

  L'architecture et la composition de la membrane jouent un rôle-clé dans la résistance à la bile. Des altérations des caractéristiques membranaires, comme la charge, l'hydrophobicité et la fluidité des lipides peuvent avoir des conséquences significatives. Des altérations dans la conformation et la structure des lipopolysaccharides membranaires occasionnées par la congélation accroissent la susceptibilité des Escherichia coli aux sels biliaires. Le gaz carbonique interagit également avec les membranes et les rendent davantage perméables aux sels biliaires. Le changement de la composition membranaire en acides gras affecte aussi la tolérance à la bile. Lactobacillus acidophilus est plus résistant aux sels biliaires à 25 °C qu'à 37 °C. Quel rapport ? Davantage d'acides gras saturés contribuent à augmenter la stabilité membranaire bactérienne = plus il y a de saturés "en solidification", moins la membrane est fluide et plus la membrane résiste aux acides biliaires. Faut-il y voir une bonne raison supplémentaire de consommer des AGPI pour fragiliser certaines membranes indésirables du microbiote ?


II - Autres effets


  Les acides biliaires perturbent la stabilité des macromolécules.

 Les acides biliaires induisent la formation des structures secondaires des ARN (repliements), induisent des dommages à l'ADN, et activent des enzymes impliquées dans la réparation de l'ADN. L'action détergente biliaire peut aussi altérer la conformation des protéines aboutissant à leur mauvais repliement et à leur dénaturation. En effet, Escherichia coli fabrique des molécules chaperonnes (protectrices des structures, appelées protéines de choc thermique ou HSP) suite à son exposition aux sels biliaires. Les sels biliaires occasionnent un stress oxydatif en faisant produire des radicaux libres oxygénés par les bactéries : 3 protéines de stress de Propionibacterium freudenreichii, jouant un rôle dans la correction des dommages oxydatifs (cystéine synthase, oxydoréductase et SOD) sont synthétisées ; les promoteurs les plus fortement activés par les sels biliaires chez Escherichia coli comprennent ceux des gènes qui répondent au stress oxydatif. La dissociation intrabactérienne des sels biliaires peut imposer un pH cellulaire bas (donc acide) ; et le mouvement des ions peut avoir de ce fait des effets osmotiques, puisque les sels biliaires peuvent chélater le calcium et le fer par exemple.

 On voit donc que les sels biliaires engendrent une pléthore de défis aux bactéries !


III - Tolérance des bactéries

 

1. Les Gram négatives

  Assez peu d'informations en réalité, mais on pense généralement que les bactéries G– sont intrinsèquement plus résistantes que les G+, et les sels biliaires sont souvent utilisés pour les enrichissements de culture. Les Salmonellae ont la capacité à coloniser la vésicule biliaire, là où la concentration en sels biliaires est extrêmement élevée. Les salmonelles ont une membrane externe qui excelle dans sa résistance aux sels biliaires. Le LPS y est pour beaucoup. La pompe protéique membranaire MDR (multi drug resistance), qui réalise l'efflux des acides biliaires hors de la membrane, est absolument requise pour la résistance. D'autres protéines sont également nécessaires. Escherichia coli est très résistant aux sels biliaires, et on l'isole communément dans la bile et la vésicule biliaire. Helicobacter bilis et hepaticus résident dans l'intestin et envahissent les canaux biliaires et le foie, alors que H. pylori est sensible à la bile, expliquant peut-être pourquoi il n'a jamais été isolé à partir d'échantillons fécaux ou de pièces de cholécystectomie. Campylobacter est aussi considéré comme résistant, on a pu l'isoler à partir de la bile et dans la vésicule biliaire.

2. Les Gram positives

  • Commensales probiotiques

  En plus de leur résistance à des pH bas, de leur adhésion à l'épithélium et de leur production de substances antimicrobiennes, la résistance à la toxicité des sels biliaires est un des critères utilisés pour sélectionner des souches de probiotiques. Mais c'est un argument faible qui ne permet pas de comparer les résultats. On peut néanmoins observer 2 récurrences.

  Tout d'abord, les bactéries G+ semblent plus sensibles aux effets délétères de la bile par rapport aux G-. Ensuite, la tolérance biliaire est souche-spécifique. Ceci a été particulièrement démontré parmi les souches de Lactobacillus (rhamnosus, plantarum, fermentum, reuteri, acidophilus, crispatus, paracasei, casei et johnsonni). On retrouve la même chose dans les souches de Propionibacterium, de Bifidobacterium, et ici B. infantis résisterait le plus et B. longum résisterait le moins aux acides biliaires, dans certaines études, mais pas dans d'autres.

  • Pathogènes

 Là aussi, assez peu d'informations détaillées sur les pathogènes G+. Listeria monocytogenes déclenche des cholécystites par colonisation vésiculaire, ce qui signifie qu'elle est tolérante à de très fortes concentrations en acides biliaires. Toutefois là encore il existe des variations souche-dépendantes, mais en partant du critère de la sensibilité, on ne peut pas remonter à l'identification des souches. Enterococcus faecalis semble rapidement tué par des sels biliaires non conjugués. Clostridium perfringens semble tolérant aux acides biliaires.


IV - Tolérance aux sels biliaires

 

  La teneur en acides biliaires n'est pas constante dans l'intestin, loin s'en faut. Elle est relativement basse après ingestion d'un repas gras. La pré-exposition des bactéries à des taux faibles de sels biliaires peut accroître leur tolérance à des taux plus forts. La présence d'aliments dans l'intestin peut affecter la survie bactérienne en sauvegardant localement les bactéries des acides biliaires, dans des micro-environnements liés aux produits alimentaires. L'encapsulation lipidique de souches de probiotiques permet d'accroître la résistance aux sels biliaires. On pense globalement que l'activité antibactérienne de la bile est moins prononcée in vivo qu'in vitro.

  La pré-exposition à un niveau sublétal d'un stress donné permet aux cellules de s'adapter et de se protéger envers un stress identique futur mais de niveau létal cette fois-ci. La pré-exposition à un stress donné peut aussi conférer une protection envers un stress de nature différente : c'est l'adaptation croisée (cross adaptation). Ce qui n'est pas tout à fait surprenant, étant donné que plusieurs stress déclenchent des effets similaires sur la physiologie cellulaire, et peuvent facilement induire la synthèse d'un même panel de protéines de stress. Les réponses aux divers stress sont en réalité interconnectées et se chevauchent.

  Les études les plus détaillées ont été réalisées avec E. coli. L'adaptation à des taux très faibles d'acides biliaires pendant une période flash de 5 secondes fournit une substantielle protection vis à vis de taux létaux en acides biliaires. L'addition de chloramphénicol pendant la période flash ne stoppe pas le développement de la tolérance acquise, ce qui suggère que l'adaptation est indépendante des protéines : on n'a pas le temps de réagir par la synthèse protéique en si peu de temps ! Puisque les détergents forment des micelles avec les lipides, ce qui aboutit rapidement à leur solubilisation et à leur désagrégation, il est possible que des acides biliaires à concentration faible s'intercalent rapidement avec les lipides membranaires, rendant ces membranes ainsi modifiées résistantes à un effet détergent futur. Mais d'autres bactéries s'adaptent différemment, la période d'induction de tolérance étant cette fois ci de plusieurs heures. Les propriétés membranaires seraient alors modifiées. Mais tous les stress sublétaux conférant une protection ultérieure sont connus pour induire des changements membranaires…

  Il est évident que les stress rencontrés in vivo au cours de la digestion influencent la tolérance bactérienne aux sels biliaires, soit directement en modifiant l'expression de gènes particuliers, soit indirectement en modifiant les caractéristiques membranaires (charge, perméabilité, fluidité). De plus, les bactéries capables d'adaptation à de faibles concentrations de bile présentes durant les périodes de repos digestif (ou de jeûne) peuvent s'adapter et accroître leur capacité à survivre aux fortes sécrétions d'acides biliaires occasionnées par la prise de nourriture. Les protéines qui prélèvent les sels biliaires ou qui les éliminent, les enzymes qui modifient et transforment les sels biliaires, jouent sans doute aussi un rôle important dans la résistance à la bile.


V - Modifications biliaires bactériennes

 

  Environ 5 % des acides biliaires ne sont pas absorbés et subissent des modifications par les enzymes du microbiote par différents moyens :

  • déconjugaison (coupure de l'acide aminé),

  • hydroxylation (remplacement d'un H par un hydroxyle OH),

  • oxydation (expulsion de H2),

  • épimérisation,

  • réduction (insertion d'H2),

  • déhydroxylation (remplacement d'un OH par un H).

 

1. Déconjugaison

  Elle est effectuée à l'aide des hydrolases biliaires. Ces enzymes sont généralement intracellulaires et insensibles à l'oxygène, et opèrent dans un créneau étroit de pH (5-6) ; leur activité est couplée à la production de la biomasse, et ils ne sont pas régulés par les sels biliaires. Il existe quelques exceptions : par exemple Clostridium perfringens possède une hydrolase extracellulaire, l'hydrolase de Lactobacillus acidophilus requiert un faible potentiel redox, et l'hydrolase de Lactobacillus johnsonni est inductible par la bile.

  L'hydrolyse des sels biliaires est réalisée par différents genres de bactéries du microbiote. (Clostridium, Bacteroïdes, Lactobacillus, Bifidobacterium et Enterococcus).

  La signification écologique de l'activité des hydrolases fait appel à 3 hypothèses. La déconjugaison confèrerait un avantage nutritionnel pour les souches hydrolytiques, car les acides aminés libérés peuvent être utilisée comme une source de carbone, d'azote et d'énergie. La glycine peut être métabolisée en ammoniaque et en CO2 ; la taurine peut donner de l'ammoniaque, du CO2 et du sulfate, qui peuvent être incorporés dans des métabolites bactériens. Ensuite, les hydrolases pourraient faciliter l'incorporation de cholestérol dans les membranes bactériennes. Cette incorporation accroît la tension superficielle membranaire, modifie sa fluidité ou sa charge, ce qui pourrait affecter la sensibilité aux alpha-défensines et à d'autres molécules de défense de l'hôte. Ceci serait donc en défaveur des pathogènes ne possédant pas d'hydrolases biliaires. Enfin, il est possible que la déconjugaison des sels biliaires représente un mécanisme de détoxification, et que les hydrolases biliaires jouent un rôle dans la tolérance biliaire (principalement vis à vis des glycoconjugués) et la survie dans le tractus intestinal. Quelques bactéries possèdent plusieurs gènes d'hydrolase biliaire (3 pour Lactobacillus johnsonni, 4 pour L. rhamnosus), ce qui majorerait l'intérêt de cette enzyme pour la survie.

  En fait, l'activité hydrolase biliaire est retrouvée principalement dans les microorganismes isolés de l'intestin des mammifères (Bifidobacterium spp, L. acidophilus, L. gasseri, L. johnsonni, quelques souches de L. plantarum) ; alors que les bactéries isolées d'environnements dépourvus de sels biliaires (laits fermentés, végétaux) comme L. lactis, L. delbrueckei, L. helveticus, S. thermophilus, ne montrent pas d'activité hydrolase biliaire.

   Les acides biliaires non conjugués montrent des effets inhibiteurs plus importants sur les bactéries que les sels biliaires conjugués, du moins in vitro. Il est cependant possible qu'ils soient précipités dans l'intestin vu le faible pH, à cause des produits de fermentation bactériens (acide lactique, butyrique…)

  La déconjugaison a d'importantes conséquences sur les propriétés physicochimiques des acides biliaires. Si les acides biliaires non conjugués sont moins efficaces que les conjugués sur l'émulsification des lipides alimentaires et sur la formation de micelles, la digestion des lipides et l'absorption des acides gras ainsi que des monoglycérides, pourrait être compromise. L'efficacité de la recirculation entérohépatique des acides biliaires est partiellement dépendante de leur reconnaissance sous forme conjuguée par les sites de transport dans l'iléon terminal. Les acides biliaires déconjugués ont une affinité diminuée pour les sites de transport et de ce fait peuvent passer dans le colon et le cæcum. Ce qui aboutit à une perte fécale accrue de sels biliaires, accroissant éventuellement la demande en cholestérol nécessaire à la synthèse de novo des acides biliaires, et donc pourrait abaisser le taux de cholestérol sanguin. De fait, la réduction de la cholestérolémie est constatée chez les porcs, les cochons d'Inde, les souris conventionnelles, et les souris axéniques colonisées avec des bactéries hydrolase-biliaire positives. Cet effet hypocholestérolémiant a attiré l'attention des chercheurs en probiotiques puisqu'il offre la possibilité d'une approche biologique dans le traitement de l'hypercholestérolémie. Si évidemment on est encore partisan du mythe du cholestérol ! Pourtant, l'activité hydrolase biliaire des probiotiques reste problématique, puisque les acides biliaires déconjugués génèrent des composés toxiques, perturbant le microbiote, déclenchant des diarrhées, des inflammations muqueuses ou l'activation de carcinogènes dans le contenu intestinal.

2. Déhydroxylation (en 7 alpha)

  Des bactéries spécifiques du genre Eubacterium et Clostridium sont les seules à déhydroxyler les acides biliaires primaires (acide cholique et acide chénodésoxycholique) en acides biliaires secondaires (respectivement acide désoxycholique et lithocholique). Au cours de cette transformation, les acides biliaires primaires sont activement transportés et internalisés pour se conjuguer au coenzyme A. Le composé ainsi obtenu est oxydé puis réduit séquentiellement et éjecté des bactéries. Les produits 7 alpha-déhydroxylés sont toxiques pour les humains (lithiases biliaires, cancer du colon).


VI - Bile et pathogenèse

 

  Les salmonelles sont inhibées pour de fortes concentrations en acides biliaires. Pour des concentrations basses, elles peuvent coloniser l'intestin et activer leurs gènes d'invasion, de virulence, et former un biofilm protecteur les mettant ainsi généralement à l'abri des antibiotiques. Les shighelles supportent les sels biliaires et en leur présence elles accroissent leur potentiel invasif en adhérant aux entérocytes. Les Campylobacter ne craignent pas non plus les acides biliaires. Enterococcus faecalis fait de même. Listeria monocytogenes peut proliférer dans les vésicules biliaires humaines, ce qui permet son échappement au système immunitaire et induit une dissémination invisible.

 

Ainsi, rien n'est finalement simple, comme toujours !